1.引物最好在模板 cDNA 的保守区内设计，保守区是不同物种同一基因的相同序列DNA 序列。

2.引物长度一般在15 ～ 30bp之间。引物长度常用的是18 ～ 27bp，过长会导致其延伸温度大于74℃，不利于PCR反应。

3.引物 GC 含量在40%~60％之 间，Tm 值最好接近68 ～ 72 ℃， GC含量过高或过低都不利于反应起始。上下游引物的GC含量不能相差太大。Tm值计算方法可参考公式Tm=4 (G+C)+2 (A+T)  。

4.引物3’端要避开密码子的第3位。如扩增编码区域，引物3’端最后一个碱基不能是密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。

5.引物3’端一般不建议选择A。当末端碱基为A时，引发错配的概率增加。

6.碱基要随机分布。引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在，像CCC或GGG，否则容易导致错误引发。

7.引物自身及引物之间不应存在互补序列。引物自身存在互补序列，容易形成发夹结构。两引物之间也不应具有互补性，以防止引物二聚体的形成。

引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话，应尽量使其△G值不要过高。二聚体的形成会降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。

8.引物5’端和中间△G值应该相对较高，而3’端△G值较低。△G值可以反映双链结构内部碱基对的相对稳定性，△G值越大，则双链越稳定。应当选用5’端和中间△G值相对较高，而3’端△G值较低的引物。

9.引物的5’端可以修饰，而3’端不可修饰。扩增是由3’端开始的，不能进行修饰，而引物的5’端不影响PCR扩增的特异性,所以可以进行修饰。

10.扩增产物的单链不能形成二级结构。在选择引物位置时，最好避开二级结构区域。

11.引物应具有特异性。引物设计完成以后，应对其进行BLAST比对，不应与其它基因互补。