PCR反应过程中会出现错配现象，这些错配分布在PCR产物的不同位置，所以我们得到的PCR产物是许多携带不同位置错配片段的混合物。PCR产物直接进行测序，如果在同一碱基处出现多次错配现象，但绝大多数片段在该位置上的碱基还是正确的，所以错配碱基会由于信号较弱而被覆盖，正确碱基被读取 。因此，用PCR产物直接进行测序，其结果可以间接反映原始模板信息。而PCR产物经克隆后测序是分析了单一片段的碱基序列。在PCR扩增过程中，每一个DNA片段都可能发生碱基错配现象。所以，PCR产物克隆过程中可能连入错配片段，其测序结果和PCR产物直接测序的结果不完全一致。